关于此实验
聚合酶链式反应（PCR）能在一个下午将一段DNA复制数十亿次。热循环仪会重复三个步骤：加热使DNA链分离，冷却使引物结合，然后加热使耐热聚合酶合成新链。每个循环都可能使目标数量翻倍。逐步运行程序，调整退火温度和延伸时间，并像实时PCR仪那样读取阈值循环。
学习目标
- 描述DNA在变性、退火和延伸步骤中发生的变化
- 解释为什么需要引物和耐热聚合酶
- 计算理想翻倍时经过n个循环后的拷贝数
- 解释扩增为何会减慢并达到平台期
- 使用阈值循环Ct比较不同样本中模板的含量
使用方法
- 1缓慢运行第一个循环。在每个步骤暂停，并描述链、引物和聚合酶分别在做什么。
- 2利用一个模板的读数，找出恰好达到目标长度的第一个分子是在第几个循环后出现的。
- 3使用对数图运行全部40个循环。为什么前期部分是一条直线？然后切换到荧光图，并描述它的形状。
- 4记录Ct，然后将起始拷贝数改变10倍。Ct会变化多少？解释这个数值。
- 5将退火温度调高到超过引物Tm。效率和产物会发生什么变化？
- 6将退火温度降至48 °C并查看凝胶。多出的条带是什么？它为什么会出现？
- 7将延伸时间缩短至10秒。为什么产生的产物会更少？
模型
假设
- 在合适的退火温度下，每个循环的效率为 95 %。当退火温度高于约 Tm + 2 °C 时，由于保持结合的引物变少，效率会平稳下降。
- 以每分钟约 1000 个碱基的延伸速度计算，500 bp 产物需要约 30 秒的延伸时间。延伸时间缩短，能够复制到末端的链数也会按比例减少。
- 退火温度远低于 Tm 时，引物可能结合到错误位点，产生更短的非目标产物，并与目标产物争夺相同的试剂。其大小和开始出现时的温度仅为示意。
- 10^12 个拷贝时的平台期和 10^10 个拷贝时的检测阈值，是使用 SYBR Green 的 25 µL 反应中常见的数量级，并非精确值。
- 单个模板对应的计数假设每轮都完美倍增，并显示长度恰好等于目标长度的分子；其余是从原始模板复制而来的较长链。
在课堂上试试这个实验
- Q1经过 30 个理想循环后，单个模板能产生多少个拷贝？
- Q2样本A的Ct值为22，样本B的Ct值为25。样本A中的模板量大约是样本B的多少倍？
- Q3为什么聚合酶必须来自生活在温泉中的细菌？
- Q4为什么引物必须结合在相反的两条链上，并且彼此相向？
- Q5试想一下，法医实验室为什么能从一根头发的毛根中制作出DNA分型？
常见问题
曲线为什么会在末端变平？
引物和核苷酸会逐渐耗尽，聚合酶在经历多轮加热循环后会失去活性，而新合成的链也越来越多地彼此配对，而不是与引物配对。这些因素都会减慢复制，因此产物不再成倍增加。
Ct值能告诉诊断实验室什么？
Ct值是荧光信号超过设定阈值时所处的循环数。起始模板量越多的样本，越早超过阈值。将Ct值与稀释系列进行比较，就能得出起始量；病毒载量检测和基因表达测量正是利用了这一原理。
谁发明了PCR？
Kary Mullis 于 1983 年描述了这一方法，并因此共同获得了 1993 年诺贝尔化学奖。使用来自水生栖热菌（Thermus aquaticus）的 Taq 聚合酶后，自动化才变得切实可行；这种酶能够耐受 95 °C 的步骤。