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PCR-Amplifikation

OberschuleBiologieDie Kopienzahl steigt pro Zyklus um den Faktor (1 + E), bis die Reagenzien aufgebraucht sind (logistisches Plateau); E sinkt, wenn die Annealing-Temperatur zu hoch oder die Extensionszeit zu kurz ist.

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Über dieses Experiment

Die Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt einen DNA-Abschnitt innerhalb eines Nachmittags milliardenfach. Ein Thermocycler wiederholt drei Schritte: Erhitzen, um die Stränge zu trennen, Abkühlen, damit sich Primer anlagern können, und Erwärmen, damit eine hitzestabile Polymerase die neuen Stränge aufbaut. In jedem Zyklus kann sich die Zielsequenz verdoppeln. Führen Sie das Programm Schritt für Schritt aus, ändern Sie die Annealing-Temperatur und die Verlängerungszeit und lesen Sie den Schwellenwert-Zyklus so ab, wie es ein Echtzeit-PCR-Gerät tut.

Lernziele

  • Beschreiben Sie, was mit der DNA während der Denaturierungs-, Annealing- und Verlängerungsschritte geschieht
  • Erklären Sie, warum Primer und eine hitzestabile Polymerase benötigt werden
  • Berechnen Sie die Anzahl der Kopien nach n Zyklen bei idealer Verdopplung
  • Erklären Sie, warum die Amplifikation langsamer wird und ein Plateau erreicht
  • Verwenden Sie den Schwellenwert-Zyklus Ct, um zu vergleichen, wie viel Vorlage die verschiedenen Proben enthielten

Anleitung

  1. 1Führe den ersten Zyklus langsam durch. Halte bei jedem Schritt an und beschreibe, was die Stränge, Primer und Polymerase gerade tun.
  2. 2Verwende die Messwerte für eine Vorlage, um herauszufinden, nach welchem Zyklus die ersten Moleküle mit genau der Ziellänge entstehen.
  3. 3Führe alle 40 Zyklen mit der logarithmischen Darstellung durch. Warum ist der frühe Abschnitt eine gerade Linie? Wechsle dann zur Fluoreszenzdarstellung und beschreibe deren Form.
  4. 4Notiere den Ct-Wert und ändere dann die Anzahl der Ausgangskopien um den Faktor 10. Wie stark ändert sich der Ct-Wert? Erkläre, warum.
  5. 5Erhöhe die Annealing-Temperatur über die Tm der Primer. Was passiert mit der Effizienz und dem Produkt?
  6. 6Senke die Annealing-Temperatur auf 48 °C und sieh dir das Gel an. Was ist die zusätzliche Bande und warum tritt sie auf?
  7. 7Verkürze die Extensionszeit auf 10 s. Warum entsteht dadurch weniger Produkt?

Das Modell

Kopienzahl nach n Zyklen bei einer Effizienz E (E = 1 entspricht einer perfekten Verdopplung)
Hier verwendete logistische Version: Die Amplifikation verlangsamt sich, wenn die Reagenzien zur Neige gehen
Moleküle mit genau der Ziellänge nach n idealen Zyklen ausgehend von einer doppelsträngigen Vorlage
Standardkurve der Echtzeit-PCR
Wallace-Regel für die Schmelztemperatur eines kurzen Primers

Annahmen

  • Bei einer geeigneten Annealing-Temperatur beträgt die Effizienz 95 % pro Zyklus. Sie sinkt allmählich, wenn die Annealing-Temperatur etwa Tm + 2 °C überschreitet, da weniger Primer gebunden bleiben.
  • Das 500-bp-Produkt benötigt bei einer Verlängerungsgeschwindigkeit von etwa 1000 Basen pro Minute ungefähr 30 s für die Verlängerung. Bei einer kürzeren Verlängerungszeit werden proportional weniger Stränge bis zum Ende kopiert.
  • Bei einer Annealing-Temperatur weit unterhalb von Tm können Primer an falschen Stellen binden und ein kürzeres Off-Target-Produkt erzeugen, das mit dem Zielprodukt um dieselben Reagenzien konkurriert. Seine Größe und die Temperatur, bei der es auftritt, dienen nur der Veranschaulichung.
  • Das Plateau bei 10^12 Kopien und die Nachweisgrenze bei 10^10 Kopien sind typische Größenordnungen für eine 25-µL-Reaktion mit SYBR Green, keine exakten Werte.
  • Die Zahlen für eine Vorlage gehen von einer perfekten Verdopplung aus und zeigen, welche Moleküle exakt die Ziellänge haben; die übrigen sind längere Stränge, die von der ursprünglichen Vorlage kopiert wurden.

Im Unterricht ausprobieren

  1. Q1Wie viele Kopien entstehen aus einer einzelnen Vorlage nach 30 idealen Zyklen?
  2. Q2Probe A hat einen Ct-Wert von 22 und Probe B einen Ct-Wert von 25. Wie viel mehr DNA-Vorlage enthielt Probe A ungefähr?
  3. Q3Warum muss die Polymerase von einem Bakterium stammen, das in heißen Quellen lebt?
  4. Q4Warum müssen die Primer an entgegengesetzte Stränge binden und aufeinander zuweisen?
  5. Q5Erkläre, warum ein forensisches Labor aus einer einzelnen Haarwurzel ein DNA-Profil erstellen kann.

Häufig gestellte Fragen

Warum flacht die Kurve am Ende ab?

Primer und Nukleotide werden aufgebraucht, die Polymerase verliert nach vielen Hitzekreisläufen an Aktivität, und neu gebildete Stränge paaren sich zunehmend miteinander statt mit Primern. All dies verlangsamt das Kopieren, sodass sich die Produktmenge nicht mehr verdoppelt.

Was sagt der Ct-Wert einem diagnostischen Labor?

Der Ct-Wert ist der Zyklus, in dem die Fluoreszenz einen festgelegten Schwellenwert überschreitet. Eine Probe mit mehr Ausgangsvorlage überschreitet ihn früher. Durch den Vergleich des Ct-Werts mit einer Verdünnungsreihe lässt sich die Ausgangsmenge bestimmen, so funktionieren Tests auf Viruslast und Messungen der Genexpression.

Wer hat die PCR erfunden?

Kary Mullis beschrieb das Verfahren 1983 und erhielt dafür 1993 den Nobelpreis für Chemie. Die Verwendung der Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, die den 95-°C-Schritt übersteht, machte die Automatisierung praktisch umsetzbar.