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Amplification par PCR

LycéeBiologieLe nombre de copies est multiplié par (1 + E) à chaque cycle jusqu’à épuisement des réactifs (plateau logistique) ; E diminue si la température d’hybridation est trop élevée ou si la durée d’élongation est trop courte.

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À propos de cette expérience

La réaction en chaîne par polymérase copie un fragment d’ADN des milliards de fois en un après-midi. Un thermocycleur répète trois étapes : chauffer pour séparer les brins, refroidir pour permettre aux amorces de se fixer, puis réchauffer afin qu’une polymérase thermostable synthétise les nouveaux brins. À chaque cycle, la quantité cible peut doubler. Exécutez le programme étape par étape, modifiez la température d’hybridation et le temps d’élongation, puis lisez le cycle seuil comme le fait un appareil de PCR en temps réel.

Objectifs pédagogiques

  • Décrivez ce qui arrive à l’ADN lors des étapes de dénaturation, d’hybridation et d’élongation
  • Expliquez pourquoi des amorces et une polymérase thermostable sont nécessaires
  • Calculez le nombre de copies après n cycles de doublement idéal
  • Expliquez pourquoi l’amplification ralentit et atteint un plateau
  • Utilisez le cycle seuil Ct pour comparer la quantité de matrice contenue dans différents échantillons

Comment l’utiliser

  1. 1Effectuez le premier cycle lentement. Faites une pause à chaque étape et décrivez ce que font les brins, les amorces et la polymérase.
  2. 2Utilisez les valeurs de lecture pour une matrice afin de déterminer après quel cycle apparaissent les premières molécules ayant exactement la longueur cible.
  3. 3Effectuez les 40 cycles avec le graphique logarithmique. Pourquoi la partie initiale est-elle une ligne droite ? Passez ensuite au graphique de fluorescence et décrivez sa forme.
  4. 4Notez le Ct, puis multipliez ou divisez le nombre de copies initial par 10. De combien le Ct change-t-il ? Expliquez cette valeur.
  5. 5Augmentez la température d’hybridation au-dessus du Tm de l’amorce. Que deviennent l’efficacité et le produit ?
  6. 6Abaissez la température d’hybridation à 48 °C et examinez le gel. Que représente la bande supplémentaire et pourquoi apparaît-elle ?
  7. 7Réduisez le temps d’élongation à 10 s. Pourquoi la quantité de produit formée diminue-t-elle ?

Le modèle

Nombre de copies après n cycles avec une efficacité E (E = 1 correspond à un doublement parfait)
Version logistique utilisée ici : l’amplification ralentit à mesure que les réactifs s’épuisent
Molécules ayant exactement la longueur cible après n cycles idéaux à partir d’une matrice double brin
Courbe étalon de PCR en temps réel
Règle de Wallace pour la température de fusion d’une amorce courte

Hypothèses

  • L’efficacité est de 95 % par cycle à une température d’hybridation adéquate. Elle diminue progressivement lorsque la température d’hybridation dépasse environ Tm + 2 °C, car moins d’amorces restent liées.
  • Le produit de 500 pb nécessite environ 30 s d’élongation à une vitesse d’environ 1000 bases par minute. Une durée d’élongation plus courte permet de copier jusqu’au bout proportionnellement moins de brins.
  • Une température d’hybridation très inférieure à Tm permet aux amorces de se fixer à des sites incorrects et de produire un produit hors cible plus court, qui entre en compétition pour les mêmes réactifs. Sa taille et la température à laquelle il apparaît sont données à titre indicatif.
  • Le plateau à 10^12 copies et le seuil de détection à 10^10 copies sont des ordres de grandeur typiques pour une réaction de 25 µL avec du SYBR Green, et non des valeurs exactes.
  • Les décomptes pour une matrice supposent un doublement parfait et indiquent quelles molécules ont exactement la longueur cible ; les autres sont des brins plus longs copiés à partir de la matrice initiale.

À essayer en classe

  1. Q1Combien de copies une matrice unique produit-elle après 30 cycles idéaux ?
  2. Q2L’échantillon A a un Ct de 22 et l’échantillon B un Ct de 25. Environ combien de fois plus de matrice l’échantillon A contenait-il ?
  3. Q3Pourquoi la polymérase doit-elle provenir d’une bactérie vivant dans des sources chaudes ?
  4. Q4Pourquoi les amorces doivent-elles se fixer sur des brins opposés et être orientées l’une vers l’autre ?
  5. Q5Expliquez pourquoi un laboratoire de police scientifique peut établir un profil ADN à partir d’une seule racine de cheveu.

Foire aux questions

Pourquoi la courbe s’aplatit-elle à la fin ?

Les amorces et les nucléotides s’épuisent, la polymérase perd de son activité après de nombreux cycles de chauffage, et les brins nouvellement synthétisés s’apparient de plus en plus entre eux plutôt qu’avec les amorces. Tout cela ralentit la copie, de sorte que la quantité de produit cesse de doubler.

Qu’indique le Ct à un laboratoire de diagnostic ?

Le Ct est le cycle auquel la fluorescence dépasse un seuil défini. Un échantillon contenant davantage de matrice au départ dépasse ce seuil plus tôt. La comparaison du Ct avec une série de dilutions permet de déterminer la quantité initiale ; c’est ainsi que fonctionnent les tests de charge virale et les mesures de l’expression génique.

Qui a inventé la PCR ?

Kary Mullis a décrit la méthode en 1983 et a partagé le prix Nobel de chimie de 1993 pour cette découverte. L’utilisation de la polymérase Taq de Thermus aquaticus, qui résiste à l’étape à 95 °C, a rendu son automatisation réalisable.