인터랙티브 PCR 증폭 시뮬레이션

이 실험 소개

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 DNA의 한 구간을 오후 한나절 동안 수십억 번 복제합니다. 열순환기는 세 단계를 반복합니다. 가열해 가닥을 분리하고, 냉각해 프라이머가 결합하도록 한 다음, 다시 가열해 내열성 중합효소가 새로운 가닥을 만들도록 합니다. 각 사이클에서 표적은 두 배로 늘어날 수 있습니다. 프로그램을 단계별로 실행하고, 어닐링 온도와 신장 시간을 바꿔 보며, 실시간 PCR 장비가 하듯 임계 사이클을 읽어 보세요.

학습 목표

변성, 어닐링, 신장 단계에서 DNA에 어떤 일이 일어나는지 설명하기
프라이머와 내열성 중합효소가 필요한 이유 설명하기
이상적으로 두 배씩 늘어날 때 n사이클 후 복제본 수 계산하기
증폭이 느려지고 정체기에 도달하는 이유 설명하기
임계 사이클 Ct를 사용해 서로 다른 샘플에 포함된 주형의 양 비교하기

사용 방법

1첫 번째 사이클을 천천히 실행하세요. 각 단계에서 멈추고 가닥, 프라이머, 중합효소가 무엇을 하는지 설명하세요.
2하나의 주형에 대한 판독 결과를 사용해 정확히 표적 길이인 첫 분자가 몇 번째 사이클 후에 나타나는지 알아보세요.
3로그 플롯을 사용해 40사이클을 모두 실행하세요. 초기 부분이 직선인 이유는 무엇인가요? 그런 다음 형광 플롯으로 전환하고 그 모양을 설명하세요.
4Ct를 기록한 다음 시작 복제 수를 10배로 변경하세요. Ct는 얼마나 달라지나요? 그 수치가 나오는 이유를 설명하세요.
5어닐링 온도를 프라이머 Tm보다 높이세요. 효율과 생성물에는 어떤 일이 일어나나요?
6어닐링 온도를 48 °C로 낮추고 겔을 확인하세요. 추가 밴드는 무엇이며 왜 나타나나요?
7신장 시간을 10초로 줄이세요. 생성물이 더 적게 만들어지는 이유는 무엇인가요?

모델

N_{n} = N_{0} (1 + E)^{n}

효율 E일 때 n사이클 후의 복제 수 (E = 1은 완벽한 두 배 증가)

N_{n + 1} = N_{n} + E N_{n} (1 - \frac{N _{n}}{N _{m a x}})

여기서 사용하는 로지스틱 버전: 시약이 소진되면서 증폭이 느려짐

2^{n} - 2 n

이중 가닥 주형 하나에서 이상적인 n사이클 후 얻어지는, 정확히 표적 길이인 분자의 수

Δ C_{t} = lo g_{1 + E} 10 \approx 3.3 cycles per tenfold dilution

실시간 PCR 표준 곡선

T_{m} \approx 2 (A + T) + 4 (G + C)^{\circ} C

짧은 프라이머의 융해 온도를 구하는 월리스 법칙

가정

적절한 어닐링 온도에서는 사이클당 효율이 95 %입니다. 어닐링 온도가 약 Tm + 2 °C보다 높아지면 결합된 상태로 남는 프라이머가 줄어들어 효율이 서서히 떨어집니다.
500 bp 산물에는 분당 약 1000염기의 신장 속도를 기준으로 약 30초의 신장 시간이 필요합니다. 신장 시간이 짧으면 끝까지 복사되는 가닥 수도 그에 비례해 줄어듭니다.
Tm보다 훨씬 낮은 온도에서 어닐링하면 프라이머가 잘못된 부위에 결합해 동일한 시약을 두고 경쟁하는 더 짧은 비표적 산물이 만들어질 수 있습니다. 그 크기와 생성이 시작되는 온도는 설명을 위한 예시입니다.
10^12개 복사본에서의 플래토와 10^10개 복사본에서의 검출 한계는 SYBR Green을 사용하는 25 µL 반응에서 일반적으로 나타나는 규모의 예시이며, 정확한 값은 아닙니다.
주형 하나에 대한 수치는 완벽한 두 배 증가를 가정하며, 정확히 표적 길이인 분자 수를 보여 줍니다. 나머지는 원래 주형에서 복사된 더 긴 가닥입니다.

수업에서 해 보기

Q1이상적인 조건에서 30회 사이클을 거치면 주형 하나로 복사본이 몇 개 만들어지나요?
Q2샘플 A의 Ct 값은 22이고 샘플 B의 Ct 값은 25입니다. 샘플 A에는 샘플 B보다 주형이 대략 몇 배 더 많이 들어 있었을까요?
Q3왜 폴리머레이스는 온천에 사는 세균에서 유래한 것이어야 하나요?
Q4프라이머는 왜 서로 반대쪽 가닥에 결합하고 서로를 향하는 방향으로 놓여야 하나요?
Q5법의학 실험실에서 머리카락 한 올의 모근만으로 DNA 프로필을 만들 수 있는 이유를 생각해 보세요.

자주 묻는 질문

곡선은 왜 끝부분에서 평평해지나요?

프라이머와 뉴클레오타이드가 소모되고, 폴리머레이스는 여러 차례의 가열 사이클을 거치면서 활성을 잃습니다. 또한 새로 만들어진 가닥은 프라이머보다 서로에게 결합하는 경우가 점점 많아집니다. 이 모든 요인이 복제를 늦추므로 산물은 더 이상 두 배로 늘어나지 않습니다.

Ct 값은 진단 검사실에 무엇을 알려 주나요?

Ct 값은 형광 신호가 설정된 임계값을 넘는 사이클 수입니다. 시작 주형이 더 많은 샘플은 더 일찍 임계값을 넘습니다. Ct 값을 희석 계열과 비교하면 시작량을 알 수 있으며, 바이러스 양 검사와 유전자 발현 측정은 이 원리를 이용합니다.

PCR은 누가 발명했나요?

Kary Mullis는 1983년에 이 방법을 설명했으며, 이 공로로 1993년 노벨 화학상을 공동 수상했습니다. 95 °C 단계에서도 살아남는 Thermus aquaticus 유래 Taq 중합효소를 사용하면서 자동화가 실용화되었습니다.