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Amplificación por PCR

Educación secundaria superiorBiologíaEl número de copias aumenta por un factor de (1 + E) en cada ciclo hasta que se agotan los reactivos (meseta logística); E disminuye si la temperatura de alineamiento es demasiado alta o el tiempo de extensión demasiado corto.

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Acerca de este experimento

La reacción en cadena de la polimerasa copia miles de millones de veces un fragmento de ADN en una tarde. Un termociclador repite tres pasos: calentar para separar las cadenas, enfriar para que los cebadores puedan unirse y calentar para que una polimerasa termoestable construya las nuevas cadenas. En cada ciclo, la cantidad objetivo puede duplicarse. Ejecute el programa paso a paso, cambie la temperatura de alineamiento y el tiempo de extensión, y lea el ciclo umbral como lo hace una máquina de PCR en tiempo real.

Objetivos de aprendizaje

  • Describa qué ocurre con el ADN en los pasos de desnaturalización, alineamiento y extensión
  • Explique por qué se necesitan cebadores y una polimerasa termoestable
  • Calcule el número de copias después de n ciclos de duplicación ideal
  • Explique por qué la amplificación se ralentiza y alcanza una meseta
  • Use el ciclo umbral Ct para comparar cuánto molde contenían las distintas muestras

Cómo usarlo

  1. 1Realiza el primer ciclo lentamente. Haz una pausa en cada paso y describe qué están haciendo las cadenas, los cebadores y la polimerasa.
  2. 2Usa las lecturas de una plantilla para averiguar después de qué ciclo aparecen las primeras moléculas con exactamente la longitud objetivo.
  3. 3Ejecuta los 40 ciclos con la gráfica logarítmica. ¿Por qué la parte inicial es una línea recta? Después, cambia a la gráfica de fluorescencia y describe su forma.
  4. 4Anota el Ct y luego cambia las copias iniciales por un factor de 10. ¿Cuánto cambia el Ct? Explica el valor.
  5. 5Aumenta la temperatura de hibridación por encima de la Tm del cebador. ¿Qué ocurre con la eficiencia y el producto?
  6. 6Baja la temperatura de hibridación a 48 °C y observa el gel. ¿Qué es la banda adicional y por qué aparece?
  7. 7Reduce el tiempo de extensión a 10 s. ¿Por qué se forma menos producto?

El modelo

Copias después de n ciclos con una eficiencia E (E = 1 corresponde a una duplicación perfecta)
Versión logística utilizada aquí: la amplificación se ralentiza a medida que se agotan los reactivos
Moléculas con exactamente la longitud objetivo después de n ciclos ideales a partir de una plantilla de doble cadena
Curva estándar de PCR en tiempo real
Regla de Wallace para la temperatura de fusión de un cebador corto

Supuestos

  • La eficiencia es del 95 % por ciclo a una temperatura de alineamiento adecuada. Disminuye gradualmente cuando la temperatura de alineamiento supera aproximadamente Tm + 2 °C, porque quedan unidos menos cebadores.
  • El producto de 500 pb necesita unos 30 s de extensión a una velocidad aproximada de 1000 bases por minuto. Con un tiempo de extensión más corto, se copian proporcionalmente menos cadenas hasta el final.
  • Una temperatura de alineamiento muy inferior a Tm permite que los cebadores se unan a sitios incorrectos y produzcan un producto inespecífico más corto que compite por los mismos reactivos. Su tamaño y la temperatura a la que aparece son ilustrativos.
  • La meseta en 10^12 copias y el umbral de detección en 10^10 copias son órdenes de magnitud típicos para una reacción de 25 µL con SYBR Green, no valores exactos.
  • Los recuentos para una plantilla suponen una duplicación perfecta y muestran qué moléculas tienen exactamente la longitud objetivo; las demás son cadenas más largas copiadas de la plantilla original.

Pruébalo en clase

  1. Q1¿Cuántas copias produce una sola plantilla después de 30 ciclos ideales?
  2. Q2La muestra A tiene un Ct = 22 y la muestra B, un Ct = 25. ¿Aproximadamente cuántas veces más molde contenía la muestra A?
  3. Q3¿Por qué la polimerasa debe proceder de una bacteria que vive en fuentes termales?
  4. Q4¿Por qué los cebadores tienen que unirse a cadenas opuestas y apuntar el uno hacia el otro?
  5. Q5Sugiere por qué un laboratorio forense puede obtener un perfil de ADN a partir de una sola raíz de cabello.

Preguntas frecuentes

¿Por qué la curva se aplana al final?

Los cebadores y los nucleótidos se agotan, la polimerasa pierde actividad tras muchos ciclos de calentamiento y las cadenas recién sintetizadas se emparejan cada vez más entre sí en vez de hacerlo con los cebadores. Todo esto ralentiza la copia, por lo que el producto deja de duplicarse.

¿Qué le indica el Ct a un laboratorio de diagnóstico?

El Ct es el ciclo en el que la fluorescencia supera un umbral establecido. Una muestra con más molde inicial lo supera antes. Comparar el Ct con una serie de diluciones permite determinar la cantidad inicial; así funcionan las pruebas de carga viral y las mediciones de expresión génica.

¿Quién inventó la PCR?

Kary Mullis describió el método en 1983 y compartió el Premio Nobel de Química de 1993 por ello. El uso de la polimerasa Taq de Thermus aquaticus, que resiste el paso a 95 °C, hizo que fuera práctico automatizarlo.