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Amplificazione mediante PCR

Scuola secondaria di secondo gradoBiologiaIl numero di copie aumenta di un fattore (1 + E) a ogni ciclo finché i reagenti non si esauriscono (plateau logistico); E diminuisce se la temperatura di annealing è troppo alta o il tempo di estensione troppo breve.

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Informazioni su questo esperimento

La reazione a catena della polimerasi copia miliardi di volte un tratto di DNA in un pomeriggio. Un termociclatore ripete tre passaggi: riscaldare per separare i filamenti, raffreddare affinché i primer possano legarsi e riscaldare affinché una polimerasi termostabile costruisca i nuovi filamenti. A ogni ciclo, la quantità bersaglio può raddoppiare. Eseguite il programma passo dopo passo, modificate la temperatura di appaiamento e il tempo di estensione e leggete il ciclo soglia come fa uno strumento per PCR in tempo reale.

Obiettivi di apprendimento

  • Descrivete cosa accade al DNA nelle fasi di denaturazione, appaiamento ed estensione
  • Spiegate perché sono necessari i primer e una polimerasi termostabile
  • Calcolate il numero di copie dopo n cicli di raddoppio ideale
  • Spiegate perché l’amplificazione rallenta e raggiunge un plateau
  • Usate il ciclo soglia Ct per confrontare la quantità di stampo contenuta nei diversi campioni

Come si usa

  1. 1Esegui lentamente il primo ciclo. Fermati a ogni passaggio e descrivi cosa stanno facendo i filamenti, i primer e la polimerasi.
  2. 2Usa i risultati relativi a uno stampo per determinare dopo quale ciclo compaiono le prime molecole con esattamente la lunghezza bersaglio.
  3. 3Esegui tutti i 40 cicli con il grafico logaritmico. Perché la parte iniziale è una linea retta? Poi passa al grafico della fluorescenza e descrivine la forma.
  4. 4Annota il Ct, poi modifica di un fattore 10 il numero di copie iniziali. Di quanto cambia il Ct? Spiega il valore.
  5. 5Aumenta la temperatura di annealing oltre la Tm del primer. Cosa succede all’efficienza e al prodotto?
  6. 6Abbassa la temperatura di annealing a 48 °C e osserva il gel. Cos’è la banda aggiuntiva e perché compare?
  7. 7Riduci il tempo di estensione a 10 s. Perché si forma meno prodotto?

Il modello

Copie dopo n cicli con efficienza E (E = 1 corrisponde a un raddoppio perfetto)
Versione logistica usata qui: l’amplificazione rallenta man mano che i reagenti si esauriscono
Molecole con esattamente la lunghezza bersaglio dopo n cicli ideali a partire da uno stampo a doppio filamento
Curva standard della PCR in tempo reale
Regola di Wallace per la temperatura di fusione di un primer corto

Ipotesi

  • L’efficienza è del 95 % per ciclo a una temperatura di annealing adeguata. Diminuisce gradualmente quando la temperatura di annealing supera di circa Tm + 2 °C, perché rimangono legati meno primer.
  • Il prodotto di 500 bp richiede circa 30 s di estensione a una velocità di circa 1000 basi al minuto. Un tempo di estensione più breve permette di copiare fino alla fine un numero proporzionalmente minore di filamenti.
  • Una temperatura di annealing molto inferiore a Tm permette ai primer di legarsi a siti errati e di produrre un prodotto aspecifico più corto, che compete per gli stessi reagenti. Le sue dimensioni e la temperatura di comparsa sono illustrative.
  • Il plateau a 10^12 copie e la soglia di rilevamento a 10^10 copie sono ordini di grandezza tipici per una reazione da 25 µL con SYBR Green, non valori esatti.
  • I conteggi per uno stampo presuppongono un raddoppio perfetto e indicano quali molecole hanno esattamente la lunghezza bersaglio; le altre sono filamenti più lunghi copiati dallo stampo originale.

Provalo in classe

  1. Q1Quante copie produce un singolo stampo dopo 30 cicli ideali?
  2. Q2Il campione A ha un Ct = 22 e il campione B un Ct = 25. Circa quante volte più stampo conteneva il campione A?
  3. Q3Perché la polimerasi deve provenire da un batterio che vive nelle sorgenti termali?
  4. Q4Perché i primer devono legarsi a filamenti opposti e puntare l’uno verso l’altro?
  5. Q5Spiega perché un laboratorio forense può ottenere un profilo del DNA da una singola radice di capello.

Domande frequenti

Perché la curva si appiattisce alla fine?

I primer e i nucleotidi si esauriscono, la polimerasi perde attività dopo molti cicli di riscaldamento e i filamenti appena sintetizzati si appaiano sempre più spesso tra loro invece che con i primer. Tutto ciò rallenta la copia, quindi il prodotto smette di raddoppiare.

Che cosa indica il Ct a un laboratorio diagnostico?

Il Ct è il ciclo in cui la fluorescenza supera una soglia prestabilita. Un campione con più stampo iniziale la supera prima. Confrontando il Ct con una serie di diluizioni si può determinare la quantità iniziale: è così che funzionano i test della carica virale e le misurazioni dell’espressione genica.

Chi ha inventato la PCR?

Kary Mullis descrisse il metodo nel 1983 e condivise il Premio Nobel per la chimica del 1993 per questa scoperta. L’uso della polimerasi Taq di Thermus aquaticus, che resiste alla fase a 95 °C, rese pratica l’automazione.