この実験について
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAの一部分を午後のうちに何十億回もコピーします。サーマルサイクラーは3つの段階を繰り返します。加熱して鎖を分離し、冷却してプライマーを結合させ、加熱して耐熱性ポリメラーゼに新しい鎖を合成させます。各サイクルで標的は倍増する可能性があります。プログラムを段階ごとに実行し、アニーリング温度と伸長時間を変更して、リアルタイムPCR装置と同じように閾値サイクルを読み取ってみましょう。
学習目標
- 変性、アニーリング、伸長の各段階でDNAに何が起こるか説明する
- プライマーと耐熱性ポリメラーゼが必要な理由を説明する
- 理想的に倍増する場合、nサイクル後のコピー数を計算する
- 増幅が遅くなり、プラトーに達する理由を説明する
- 閾値サイクルCtを使って、異なるサンプルに含まれていた鋳型の量を比較する
使い方
- 1最初のサイクルをゆっくり実行します。各ステップで一時停止し、DNA鎖、プライマー、ポリメラーゼが何をしているか説明してください。
- 21つの鋳型の読み取り結果を使って、ちょうど標的長の最初の分子が何サイクル後に現れるかを調べてください。
- 3対数プロットを使って40サイクルすべてを実行します。初期部分が直線になるのはなぜですか？次に蛍光プロットに切り替え、その形状を説明してください。
- 4Ctを記録してから、開始コピー数を10倍に変更します。Ctはどれくらい変化しますか？その数値の理由を説明してください。
- 5アニーリング温度をプライマーのTmより高くします。効率と生成物はどうなりますか？
- 6アニーリング温度を48 °Cまで下げ、ゲルを確認します。余分なバンドは何で、なぜ現れるのでしょうか？
- 7伸長時間を10秒に短縮します。生成物が少なくなるのはなぜですか？
モデル
前提条件
- 適切なアニーリング温度では、1サイクルあたりの効率は95 %です。アニーリング温度がTm + 2 °C程度を超えると、結合したままのプライマーが少なくなるため、効率は徐々に低下します。
- 500 bpの産物には、毎分約1000塩基の伸長速度で約30秒の伸長時間が必要です。伸長時間が短いと、最後までコピーされる鎖の数はそれに比例して少なくなります。
- Tmより大幅に低い温度でアニーリングすると、プライマーが誤った部位に結合し、同じ試薬を奪い合う短い非特異的産物ができることがあります。そのサイズと生成開始温度は説明のための例です。
- 10^12コピーでのプラトーと10^10コピーでの検出閾値は、SYBR Greenを用いた25 µL反応で一般的に見られる桁の目安であり、正確な値ではありません。
- 鋳型1分子の場合の数は、完全に倍増することを仮定し、ちょうど標的長の分子を示しています。残りは、元の鋳型からコピーされた、より長い鎖です。
授業で試してみましょう
- Q1理想的な条件で30サイクル行うと、鋳型1分子から何コピーできますか？
- Q2サンプルAのCt値は22、サンプルBのCt値は25です。サンプルAに含まれる鋳型は、サンプルBのおよそ何倍でしょうか？
- Q3なぜポリメラーゼは、温泉に生息する細菌に由来するものでなければならないのでしょうか？
- Q4なぜプライマーは互いに反対側の鎖に結合し、互いに向き合う方向を向いていなければならないのでしょうか？
- Q5法医学研究所が毛根1本からDNAプロファイルを作成できるのはなぜか、考えてみましょう。
よくある質問
曲線はなぜ終わりに平らになるのでしょうか？
プライマーとヌクレオチドは使い果たされ、ポリメラーゼは加熱サイクルを何度も経るうちに活性を失います。また、新たに作られた鎖は、プライマーよりも互いに結合する割合が高くなります。これらすべてが複製の速度を遅くするため、生成物は倍増しなくなります。
Ct値から診断検査室は何がわかりますか？
Ct値とは、蛍光シグナルが設定された閾値を超えるサイクル数です。開始時の鋳型が多いサンプルほど、早いサイクルで閾値を超えます。Ct値を希釈系列と比較することで開始時の量がわかります。ウイルス量検査や遺伝子発現測定は、この仕組みを利用しています。
PCRを発明したのは誰ですか？
Kary Mullisは1983年にこの方法を発表し、その功績により1993年のノーベル化学賞を共同受賞しました。95 °Cの工程を生き延びるThermus aquaticus由来のTaqポリメラーゼを使うことで、自動化が実用的になりました。