關於此實驗
聚合酶連鎖反應（PCR）能在一個下午將一段DNA複製數十億次。熱循環儀會重複三個步驟：加熱使DNA鏈分離，冷卻使引子結合，然後加熱使耐熱聚合酶合成新鏈。每個循環都可能使目標數量倍增。逐步執行程式，調整退火溫度和延伸時間，並像即時PCR儀器那樣讀取閾值循環。
學習目標
- 描述DNA在變性、退火和延伸步驟中發生的變化
- 解釋為什麼需要引子和耐熱聚合酶
- 計算理想倍增時經過n個循環後的拷貝數
- 解釋擴增為何會減慢並達到平台期
- 使用閾值循環Ct比較不同樣本中模板的含量
使用方法
- 1緩慢執行第一個循環。在每個步驟暫停，並描述鏈、引子和聚合酶分別在做什麼。
- 2利用一個模板的讀數，找出長度恰好等於目標長度的第一個分子是在第幾個循環後出現的。
- 3使用對數圖執行全部40個循環。為什麼前期部分是一條直線？接著切換到螢光圖，並描述它的形狀。
- 4記錄Ct，然後將起始拷貝數改變10倍。Ct會改變多少？請解釋這個數值。
- 5將退火溫度調高至超過引子的Tm。效率和產物會有什麼變化？
- 6將退火溫度降至48 °C並查看凝膠。多出來的條帶是什麼？它為什麼會出現？
- 7將延伸時間縮短至10秒。為什麼產生的產物會較少？
模型
假設
- 在合適的退火溫度下，每個循環的效率為 95 %。當退火溫度高於約 Tm + 2 °C 時，由於維持結合的引子減少，效率會平穩下降。
- 以每分鐘約 1000 個鹼基的延伸速度計算，500 bp 產物需要約 30 秒的延伸時間。延伸時間縮短，能複製到末端的鏈數也會按比例減少。
- 退火溫度遠低於 Tm 時，引子可能結合到錯誤位點，產生較短的非目標產物，並與目標產物爭奪相同的試劑。其大小和開始出現時的溫度僅為示意。
- 10^12 個拷貝時的平台期和 10^10 個拷貝時的檢測閾值，是使用 SYBR Green 的 25 µL 反應中常見的數量級，並非精確值。
- 單一模板的計數假設每輪都完美倍增，並顯示長度恰好等於目標長度的分子；其餘是從原始模板複製而來的較長鏈。
在課堂上試試這個實驗
- Q1經過 30 個理想循環後，單一模板能產生多少個拷貝？
- Q2樣本A的Ct值為22，樣本B的Ct值為25。樣本A中的模板量大約是樣本B的幾倍？
- Q3為什麼聚合酶必須來自生活在溫泉中的細菌？
- Q4為什麼引子必須結合在相反的兩股上，並且彼此相向？
- Q5試想一下，法醫實驗室為什麼能從一根頭髮的毛根中製作出DNA分型？
常見問題
曲線為什麼會在末端變平？
引子和核苷酸會逐漸耗盡，聚合酶在經歷多輪加熱循環後會失去活性，而新合成的鏈也越來越常彼此配對，而不是與引子配對。這些因素都會減慢複製，因此產物不再倍增。
Ct值能告訴診斷實驗室什麼？
Ct值是螢光訊號超過設定閾值時所處的循環數。起始模板量越多的樣本，越早超過閾值。將Ct值與稀釋系列進行比較，就能得出起始量；病毒量檢測和基因表現測量正是利用了這個原理。
誰發明了PCR？
Kary Mullis 於 1983 年描述了這種方法，並因此共同獲得 1993 年諾貝爾化學獎。使用來自水生棲熱菌（Thermus aquaticus）的 Taq 聚合酶後，自動化才變得切實可行；這種酶能耐受 95 °C 的步驟。