关于此实验
底物浓度较低时，底物越多，酶的作用速度就越快；但最终所有活性位点都会被占据，反应速率也会趋于平稳。1913 年，Leonor Michaelis 和 Maud Menten 用两个数值描述了这一现象：最高反应速率 Vmax，以及反应速率达到其一半时的底物浓度 Km。调整这两个数值，添加三种抑制剂，观察它们如何改变曲线和 Lineweaver-Burk 图；然后分别用传统方法和现代方法拟合带有噪声的测定数据。
学习目标
- 从米氏方程推导 Vmax 和 Km 的含义
- 从饱和曲线和 Lineweaver-Burk 图中读取 Km 和 Vmax
- 根据对表观常数的影响，区分竞争性抑制、反竞争性抑制和非竞争性抑制
- 解释双倒数图为何会扭曲测量误差
- 比较线性化拟合与非线性最小二乘拟合
使用方法
- 1沿曲线拖动。当 [S] 为多少时，反应速率是 Vmax 的一半？与 Km 对照验证。
- 2将 [S] 设为 10 Km。达到 Vmax 的几分之几？为什么曲线始终无法完全达到 Vmax？
- 3添加竞争性抑制剂并增大 [I]/Ki。哪个常数会发生变化？在 Lineweaver-Burk 图上，各直线在哪里相交？
- 4对反竞争性抑制和非竞争性抑制重复上述操作。画出三种 Lineweaver-Burk 图的模式。
- 5将测量误差设为 0.5，进行几次新的测定。比较 Lineweaver-Burk 法的估计值与非线性拟合结果。哪种方法更可靠？
- 6看看 Lineweaver-Burk 图中最靠右的点。为什么它们会对直线产生如此大的影响？
模型
假设
- 单底物酶的稳态动力学：底物相对于酶大量过量，且只测量初始速率。
- 这里的非竞争性指纯非竞争性抑制：抑制剂与游离酶和酶复合物的结合能力相同。图中未显示混合型抑制。
- 每次测定使用八种底物浓度，并为每个点加入大小相同的随机误差。随机数生成器使用固定种子，因此可以重复运行并得到相同结果。
- 非线性拟合采用 v 对 [S] 的普通最小二乘法，从 Lineweaver-Burk 估计值开始用 Gauss-Newton 法求解。
在课堂上试试这个实验
- Q1某种酶的 Vmax = 12 µM/s，Km = 3 mM。当 [S] = 1 mM 和 [S] = 9 mM 时，反应速率分别是多少？
- Q2Lineweaver-Burk直线的截距为0.08 s/µM，斜率为0.24 s·mM/µM。求Vmax和Km。
- Q3底物浓度非常高时，为什么竞争性抑制剂不起作用？
- Q4许多药物都是酶抑制剂。药物设计者为什么可能更偏好非竞争性抑制剂？
- Q5解释为什么在Lineweaver-Burk拟合中，[S]较低的点影响更大。
常见问题
Km和底物的结合常数相同吗？
只有当催化步骤远慢于底物再次解离的步骤时才是如此（k_cat远小于k₋₁）。一般而言，Km也包含k_cat，因此Km较低意味着结合和转化都很有效，而不仅仅是结合紧密。
既然Lineweaver-Burk图并不可靠，为什么还要教它？
它能将曲线变成直线，使不同抑制剂的模式很容易通过目测辨认。要获得实际数值，研究人员会用非线性回归拟合原始曲线。
这条曲线从哪里开始不再符合这个方程？
像天冬氨酸氨甲酰转移酶这样亚基协同工作的变构酶会呈现S形曲线。底物浓度过高也可能抑制某些酶。