Cinétique enzymatique de Michaelis-Menten

À propos de cette expérience

À faible concentration en substrat, plus une enzyme reçoit de substrat, plus elle travaille vite. Mais les sites actifs finissent par être tous occupés et la vitesse atteint un plateau. En 1913, Leonor Michaelis et Maud Menten ont décrit ce phénomène à l’aide de deux valeurs : Vmax, la vitesse maximale, et Km, la concentration en substrat correspondant à la moitié de cette vitesse. Modifiez ces deux valeurs, ajoutez trois types d’inhibiteurs et observez comment chacun influe sur la courbe et le graphique de Lineweaver-Burk. Ajustez ensuite des données d’essai bruitées avec l’ancienne méthode, puis avec la méthode moderne.

Objectifs pédagogiques

Déduisez la signification de Vmax et de Km à partir de l’équation de Michaelis-Menten
Déterminez Km et Vmax à partir d’une courbe de saturation et d’un graphique de Lineweaver-Burk
Distinguez l’inhibition compétitive, incompétitive et non compétitive par leur effet sur les constantes apparentes
Expliquez pourquoi le graphique en doubles inverses déforme les erreurs de mesure
Comparez un ajustement linéarisé à un ajustement non linéaire par la méthode des moindres carrés

Comment l’utiliser

1Déplacez-vous le long de la courbe. Pour quelle valeur de [S] la vitesse vaut-elle la moitié de Vmax ? Vérifiez que cela correspond à Km.
2Réglez [S] sur 10 Km. Quelle fraction de Vmax est atteinte ? Pourquoi la courbe n’atteint-elle jamais tout à fait Vmax ?
3Ajoutez un inhibiteur compétitif et augmentez [I]/Ki. Quelle constante change ? Où les droites se croisent-elles sur le graphique de Lineweaver-Burk ?
4Répétez l’expérience avec une inhibition incompétitive et non compétitive. Esquissez les trois configurations de Lineweaver-Burk.
5Réalisez plusieurs nouveaux essais avec une erreur de mesure de 0,5. Comparez les estimations obtenues avec Lineweaver-Burk à l’ajustement non linéaire. Quelle méthode est la plus fiable ?
6Regardez quels points se trouvent le plus à droite sur le graphique de Lineweaver-Burk. Pourquoi ont-ils une si grande influence sur la droite ?

Le modèle

v = \frac{V _{m a x} [ S ]}{K _{m} + [ S ]}

Équation de Michaelis-Menten pour la vitesse initiale

\frac{1}{v} = \frac{K _{m}}{V _{m a x}} \cdot \frac{1}{[ S ]} + \frac{1}{V _{m a x}}

Forme de Lineweaver-Burk (double réciproque)

V_{m a x} = k_{cat} [E]_{0}, K_{m} = \frac{k _{- 1} + k _{cat}}{k _{1}}

Constantes du mécanisme à l’état stationnaire E + S ⇌ ES → E + P

competitive: K_{m}^{app} = α K_{m} uncompetitive: \frac{V _{m a x}}{α}, \frac{K _{m}}{α} noncompetitive: \frac{V _{m a x}}{α}

Constantes apparentes en présence d’un inhibiteur, α = 1 + [I]/Ki

Hypothèses

Cinétique à l’état stationnaire d’une enzyme à substrat unique : le substrat est en grand excès par rapport à l’enzyme et seules les vitesses initiales sont mesurées.
Ici, non compétitive désigne une inhibition non compétitive pure : l’inhibiteur se lie aussi bien à l’enzyme libre qu’au complexe. L’inhibition mixte n’est pas représentée.
Chaque essai mesure huit concentrations de substrat avec une erreur aléatoire constante, identique pour tous les points, générée à partir d’une graine afin de pouvoir répéter une exécution.
L’ajustement non linéaire utilise les moindres carrés ordinaires de v en fonction de [S] et est résolu par la méthode de Gauss-Newton à partir de l’estimation de Lineweaver-Burk.

À essayer en classe

Q1Une enzyme a un Vmax = 12 µM/s et un Km = 3 mM. Quelle est la vitesse lorsque [S] = 1 mM et lorsque [S] = 9 mM ?
Q2Une droite de Lineweaver-Burk a une ordonnée à l’origine de 0,08 s/µM et une pente de 0,24 s·mM/µM. Déterminez Vmax et Km.
Q3Pourquoi un inhibiteur compétitif est-il sans effet lorsque la concentration en substrat est très élevée ?
Q4De nombreux médicaments sont des inhibiteurs enzymatiques. Pourquoi un concepteur de médicaments pourrait-il préférer un inhibiteur non compétitif ?
Q5Expliquez pourquoi les points à faible [S] dominent l’ajustement de Lineweaver-Burk.

Foire aux questions

Km est-il identique à la constante de liaison du substrat ?

Uniquement lorsque l’étape catalytique est beaucoup plus lente que le départ ultérieur du substrat (k_cat est beaucoup plus petit que k₋₁). En général, Km inclut aussi k_cat ; une faible valeur de Km signifie donc que la liaison et la conversion sont toutes deux efficaces, et pas seulement que la liaison est forte.

Pourquoi enseigne-t-on encore le graphique de Lineweaver-Burk s’il n’est pas fiable ?

Il transforme la courbe en une droite, ce qui permet de reconnaître facilement à l’œil les profils associés aux différents inhibiteurs. Pour obtenir des valeurs précises, les chercheurs ajustent la courbe d’origine par régression non linéaire.

À partir de quand la courbe cesse-t-elle de suivre cette équation ?

Les enzymes allostériques dont les sous-unités coopèrent, comme l'aspartate transcarbamoylase, donnent plutôt des courbes en forme de S. Des concentrations de substrat très élevées peuvent également inhiber certaines enzymes.