Informazioni su questo esperimento
A basse concentrazioni di substrato, più substrato riceve un enzima, più velocemente lavora. Ma prima o poi tutti i siti attivi si occupano e la velocità raggiunge un plateau. Nel 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten descrissero questo fenomeno con due valori: Vmax, la velocità massima, e Km, la concentrazione di substrato alla quale si raggiunge metà di quella velocità. Modifica entrambi i valori, aggiungi tre tipi di inibitori e osserva come ciascuno sposta la curva e il grafico di Lineweaver-Burk. Infine, adatta i dati sperimentali rumorosi con il metodo tradizionale e con quello moderno.
Obiettivi di apprendimento
- Dedurre il significato di Vmax e Km dall’equazione di Michaelis-Menten
- Ricavare Km e Vmax da una curva di saturazione e da un grafico di Lineweaver-Burk
- Distinguere l’inibizione competitiva, incompetitiva e non competitiva in base al loro effetto sulle costanti apparenti
- Spiegare perché il grafico dei doppi reciproci distorce gli errori di misurazione
- Confrontare un adattamento linearizzato con un adattamento non lineare ai minimi quadrati
Come si usa
- 1Spostarsi lungo la curva. Per quale valore di [S] la velocità è la metà di Vmax? Verificare il risultato confrontandolo con Km.
- 2Impostare [S] su 10 Km. Quale frazione di Vmax viene raggiunta? Perché la curva non raggiunge mai del tutto Vmax?
- 3Aggiungere un inibitore competitivo e aumentare [I]/Ki. Quale costante cambia? Dove si intersecano le rette nel grafico di Lineweaver-Burk?
- 4Ripetere per l’inibizione incompetitiva e non competitiva. Disegnare i tre schemi di Lineweaver-Burk.
- 5Eseguire diverse nuove prove con un errore di misurazione di 0,5. Confrontare le stime ottenute con Lineweaver-Burk con l’adattamento non lineare. Quale metodo è più affidabile?
- 6Osserva quali punti si trovano più a destra nel grafico di Lineweaver-Burk. Perché influenzano così tanto la retta?
Il modello
Ipotesi
- Cinetica allo stato stazionario di un enzima a substrato singolo: il substrato è in grande eccesso rispetto all’enzima e si misurano solo le velocità iniziali.
- Qui, non competitiva significa inibizione non competitiva pura: l’inibitore si lega con uguale affinità all’enzima libero e al complesso. L’inibizione mista non è mostrata.
- Ogni saggio misura otto concentrazioni di substrato con un errore casuale costante, uguale per tutti i punti e generato a partire da un seme, così da poter ripetere un’esecuzione.
- L’adattamento non lineare utilizza i minimi quadrati ordinari di v rispetto a [S] e viene risolto con il metodo di Gauss-Newton, partendo dalla stima di Lineweaver-Burk.
Provalo in classe
- Q1Un enzima ha Vmax = 12 µM/s e Km = 3 mM. Qual è la velocità quando [S] = 1 mM e quando [S] = 9 mM?
- Q2Una retta di Lineweaver-Burk ha un’intercetta di 0,08 s/µM e una pendenza di 0,24 s·mM/µM. Trova Vmax e Km.
- Q3Perché un inibitore competitivo non ha effetto quando la concentrazione di substrato è molto alta?
- Q4Molti farmaci sono inibitori enzimatici. Perché un progettista di farmaci potrebbe preferire un inibitore non competitivo?
- Q5Spiega perché i punti a [S] bassa dominano l’adattamento di Lineweaver-Burk.
Domande frequenti
Km è uguale alla costante di legame del substrato?
Solo quando la fase catalitica è molto più lenta del successivo distacco del substrato (k_cat è molto più piccolo di k₋₁). In generale, Km include anche k_cat, quindi un Km basso indica sia un legame efficiente sia un turnover efficiente, non soltanto un legame forte.
Perché si insegna ancora il grafico di Lineweaver-Burk se è inaffidabile?
Trasforma la curva in una retta, rendendo facile riconoscere a colpo d’occhio gli schemi dei diversi inibitori. Per ottenere valori effettivi, i ricercatori adattano la curva originale con una regressione non lineare.
Da dove in poi la curva smette di seguire questa equazione?
Gli enzimi allosterici le cui subunità cooperano, come l'aspartato transcarbamoilasi, producono invece curve a forma di S. Concentrazioni molto elevate di substrato possono anche inibire alcuni enzimi.