이 실험 소개
기질 농도가 낮을 때는 기질이 많을수록 효소가 더 빠르게 작용하지만, 결국 모든 활성 부위가 차면 반응 속도는 더 이상 증가하지 않습니다. 1913년 레오노르 미카엘리스와 모드 멘텐은 이 현상을 두 가지 수치로 설명했습니다. 최고 속도인 Vmax와 그 속도의 절반에 도달하는 기질 농도인 Km입니다. 두 값을 바꾸고 세 종류의 저해제를 추가해 각각이 곡선과 라인위버-버크 플롯을 어떻게 변화시키는지 확인한 다음, 잡음이 있는 분석 데이터를 전통적인 방법과 현대적인 방법으로 피팅해 보세요.
학습 목표
- 미카엘리스-멘텐 방정식에서 Vmax와 Km의 의미를 도출하세요
- 포화 곡선과 라인위버-버크 플롯에서 Km과 Vmax를 읽어내세요
- 겉보기 상수에 미치는 영향으로 경쟁적 저해, 무경쟁적 저해, 비경쟁적 저해를 구별하세요
- 이중 역수 플롯이 측정 오차를 왜곡하는 이유를 설명하세요
- 선형화한 피팅과 비선형 최소제곱 피팅을 비교하세요
사용 방법
- 1곡선을 따라 드래그하세요. 반응 속도가 Vmax의 절반이 되는 [S]는 얼마인가요? Km과 비교해 확인하세요.
- 2[S]를 10 Km으로 설정하세요. Vmax의 몇 분율에 도달하나요? 곡선이 Vmax에 완전히 도달하지 않는 이유는 무엇인가요?
- 3경쟁적 저해제를 추가하고 [I]/Ki를 높이세요. 어떤 상수가 변하나요? 라인위버-버크 플롯에서 직선은 어디에서 만나나요?
- 4무경쟁적 저해와 비경쟁적 저해에 대해서도 반복하세요. 세 가지 라인위버-버크 패턴을 스케치하세요.
- 5측정 오차를 0.5로 설정해 새로운 분석을 여러 번 수행하세요. 라인위버-버크 추정치와 비선형 피팅 결과를 비교하세요. 어느 쪽이 더 신뢰할 만한가요?
- 6Lineweaver-Burk 플롯에서 가장 오른쪽에 있는 점들을 살펴보세요. 왜 이 점들이 직선에 그렇게 큰 영향을 미칠까요?
모델
가정
- 단일 기질 효소의 정상 상태 동역학: 기질은 효소에 비해 크게 과량으로 존재하며 초기 속도만 측정합니다.
- 여기서 비경쟁 저해는 순수 비경쟁 저해를 뜻합니다. 저해제는 자유 효소와 효소 복합체에 똑같이 잘 결합합니다. 혼합 저해는 표시하지 않았습니다.
- 각 분석에서는 기질 농도 8개를 측정하며, 모든 측정점에 동일한 크기의 무작위 오차를 적용합니다. 시드가 지정된 난수 생성기를 사용하므로 실행을 반복할 수 있습니다.
- 비선형 피팅은 Lineweaver-Burk 추정값에서 시작해 Gauss-Newton법으로 v 대 [S]의 일반 최소제곱을 풉니다.
수업에서 해 보기
- Q1한 효소의 Vmax = 12 µM/s이고 Km = 3 mM입니다. [S] = 1 mM일 때와 [S] = 9 mM일 때의 반응 속도는 얼마인가요?
- Q2Lineweaver-Burk 직선의 절편은 0.08 s/µM이고 기울기는 0.24 s·mM/µM입니다. Vmax와 Km을 구하세요.
- Q3기질 농도가 매우 높을 때 경쟁적 저해제는 왜 효과가 없나요?
- Q4많은 약물이 효소 저해제입니다. 약물 설계자는 왜 비경쟁적 저해제를 선호할 수 있을까요?
- Q5Lineweaver-Burk 피팅에서 [S]가 낮은 점들이 큰 영향을 미치는 이유를 설명하세요.
자주 묻는 질문
Km은 기질의 결합 상수와 같은가요?
촉매 단계가 기질이 다시 떨어져 나가는 단계보다 훨씬 느릴 때에만 그렇습니다(k_cat이 k₋₁보다 훨씬 작을 때). 일반적으로 Km에는 k_cat도 포함되므로, Km이 낮다는 것은 단단한 결합만이 아니라 결합과 전환이 모두 효율적임을 의미합니다.
신뢰성이 낮은데도 Lineweaver-Burk 플롯을 여전히 가르치는 이유는 무엇인가요?
곡선을 직선으로 바꾸면 저해제마다 나타나는 패턴을 눈으로 쉽게 알아볼 수 있습니다. 실제 수치를 구할 때 연구자들은 비선형 회귀로 원래 곡선을 피팅합니다.
곡선은 어디서부터 이 방정식을 따르지 않나요?
아스파르트산 트랜스카바모일레이스처럼 소단위체가 협력하는 알로스테릭 효소는 대신 S자형 곡선을 나타냅니다. 기질 농도가 매우 높으면 일부 효소가 억제될 수도 있습니다.