Acerca de este experimento
A bajas concentraciones de sustrato, cuanto más sustrato recibe una enzima, más rápido trabaja. Sin embargo, llega un momento en que todos los sitios activos están ocupados y la velocidad se estabiliza. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten describieron este comportamiento con dos valores: Vmax, la velocidad máxima, y Km, la concentración de sustrato a la que se alcanza la mitad de esa velocidad. Cambia ambos valores, añade tres tipos de inhibidores y observa cómo cada uno modifica la curva y el gráfico de Lineweaver-Burk. Después, ajusta datos de ensayo con ruido tanto a la antigua como a la moderna.
Objetivos de aprendizaje
- Deduce el significado de Vmax y Km a partir de la ecuación de Michaelis-Menten
- Determine Km y Vmax en una curva de saturación y en un gráfico de Lineweaver-Burk
- Distinga la inhibición competitiva, acompetitiva y no competitiva por su efecto en las constantes aparentes
- Explique por qué el gráfico de dobles recíprocos distorsiona los errores de medición
- Compare un ajuste linealizado con un ajuste no lineal por mínimos cuadrados
Cómo usarlo
- 1Desplácese por la curva. ¿Para qué valor de [S] es la velocidad la mitad de Vmax? Compárelo con Km.
- 2Fije [S] en 10 Km. ¿Qué fracción de Vmax se alcanza? ¿Por qué la curva nunca llega del todo a Vmax?
- 3Añada un inhibidor competitivo y aumente [I]/Ki. ¿Qué constante cambia? ¿Dónde se cruzan las rectas en el gráfico de Lineweaver-Burk?
- 4Repita el procedimiento para la inhibición acompetitiva y no competitiva. Dibuje los tres patrones de Lineweaver-Burk.
- 5Realice varios ensayos nuevos con un error de medición de 0,5. Compare las estimaciones de Lineweaver-Burk con el ajuste no lineal. ¿Cuál es más fiable?
- 6Fíjate en qué puntos están más a la derecha en el gráfico de Lineweaver-Burk. ¿Por qué influyen tanto en la recta?
El modelo
Supuestos
- Cinética en estado estacionario de una enzima con un único sustrato: el sustrato está en gran exceso con respecto a la enzima y solo se miden velocidades iniciales.
- Aquí, no competitiva significa inhibición no competitiva pura: el inhibidor se une igual de bien a la enzima libre y al complejo. No se muestra la inhibición mixta.
- Cada ensayo mide ocho concentraciones de sustrato con un error aleatorio constante, igual para todos los puntos, generado a partir de una semilla para poder repetir una ejecución.
- El ajuste no lineal utiliza mínimos cuadrados ordinarios de v frente a [S] y se resuelve mediante Gauss-Newton, partiendo de la estimación de Lineweaver-Burk.
Pruébalo en clase
- Q1Una enzima tiene Vmax = 12 µM/s y Km = 3 mM. ¿Cuál es la velocidad cuando [S] = 1 mM y cuando [S] = 9 mM?
- Q2Una recta de Lineweaver-Burk tiene una ordenada en el origen de 0,08 s/µM y una pendiente de 0,24 s·mM/µM. Halla Vmax y Km.
- Q3¿Por qué un inhibidor competitivo no tiene efecto cuando la concentración de sustrato es muy alta?
- Q4Muchos fármacos son inhibidores enzimáticos. ¿Por qué podría preferir un diseñador de fármacos un inhibidor no competitivo?
- Q5Explica por qué los puntos con [S] baja dominan el ajuste de Lineweaver-Burk.
Preguntas frecuentes
¿Es Km lo mismo que la constante de unión del sustrato?
Solo cuando el paso catalítico es mucho más lento que la salida posterior del sustrato (k_cat mucho menor que k₋₁). En general, Km también incluye k_cat, así que un Km bajo significa que tanto la unión como la conversión son eficientes, no solo que la unión es estrecha.
¿Por qué se sigue enseñando la gráfica de Lineweaver-Burk si no es fiable?
Convierte la curva en una recta, lo que facilita reconocer a simple vista los patrones de los distintos inhibidores. Para obtener valores reales, los investigadores ajustan la curva original mediante regresión no lineal.
¿A partir de qué punto deja la curva de seguir esta ecuación?
Las enzimas alostéricas cuyas subunidades cooperan, como la aspartato transcarbamoilasa, producen curvas en forma de S. Las concentraciones muy altas de sustrato también pueden inhibir algunas enzimas.