Über dieses Experiment
Bei niedriger Substratkonzentration arbeitet ein Enzym umso schneller, je mehr Substrat es erhält. Doch irgendwann sind alle aktiven Zentren besetzt und die Reaktionsgeschwindigkeit erreicht ein Plateau. 1913 beschrieben Leonor Michaelis und Maud Menten diesen Zusammenhang mit zwei Größen: Vmax, der Höchstgeschwindigkeit, und Km, der Substratkonzentration bei halber Höchstgeschwindigkeit. Ändere beide Werte, füge drei Arten von Inhibitoren hinzu und beobachte, wie jede davon die Kurve und den Lineweaver-Burk-Plot verändert. Passe anschließend verrauschte Messdaten auf die alte und die moderne Art an.
Lernziele
- Leiten Sie die Bedeutung von Vmax und Km aus der Michaelis-Menten-Gleichung her
- Lesen Sie Km und Vmax aus einer Sättigungskurve und einem Lineweaver-Burk-Diagramm ab
- Unterscheiden Sie kompetitive, unkompetitive und nichtkompetitive Hemmung anhand ihrer Wirkung auf die scheinbaren Konstanten
- Erklären Sie, warum das doppelt reziproke Diagramm Messfehler verzerrt
- Vergleichen Sie eine linearisierte Anpassung mit einer nichtlinearen Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate
Anleitung
- 1Bewegen Sie sich entlang der Kurve. Bei welchem [S] beträgt die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte von Vmax? Vergleichen Sie den Wert mit Km.
- 2Setzen Sie [S] auf 10 Km. Welcher Anteil von Vmax wird erreicht? Warum erreicht die Kurve Vmax nie ganz?
- 3Fügen Sie einen kompetitiven Inhibitor hinzu und erhöhen Sie [I]/Ki. Welche Konstante ändert sich? Wo schneiden sich die Linien im Lineweaver-Burk-Diagramm?
- 4Wiederholen Sie den Vorgang für unkompetitive und nichtkompetitive Hemmung. Skizzieren Sie die drei Muster im Lineweaver-Burk-Diagramm.
- 5Führen Sie mehrere neue Messreihen mit einem Messfehler von 0,5 durch. Vergleichen Sie die Schätzwerte aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm mit der nichtlinearen Anpassung. Welche Methode ist zuverlässiger?
- 6Schauen Sie sich an, welche Punkte im Lineweaver-Burk-Diagramm am weitesten rechts liegen. Warum haben sie so großen Einfluss auf die Gerade?
Das Modell
Annahmen
- Kinetik einer Einzelsubstrat-Enzymreaktion im stationären Zustand: Das Substrat liegt im großen Überschuss gegenüber dem Enzym vor, und es werden nur Anfangsgeschwindigkeiten gemessen.
- Nichtkompetitiv bedeutet hier eine reine nichtkompetitive Hemmung: Der Inhibitor bindet gleich gut an das freie Enzym und an den Enzym-Substrat-Komplex. Eine gemischte Hemmung ist nicht dargestellt.
- Jeder Test misst acht Substratkonzentrationen mit einem konstanten zufälligen Fehler, der für alle Punkte gleich ist und von einem Startwert abhängigen Zufallszahlengenerator erzeugt wird, sodass sich ein Durchlauf wiederholen lässt.
- Die nichtlineare Anpassung erfolgt mittels gewöhnlicher kleinster Quadrate für v gegen [S] und wird ausgehend von der Lineweaver-Burk-Schätzung mit dem Gauss-Newton-Verfahren gelöst.
Im Unterricht ausprobieren
- Q1Ein Enzym hat Vmax = 12 µM/s und Km = 3 mM. Wie hoch ist die Geschwindigkeit bei [S] = 1 mM und bei [S] = 9 mM?
- Q2Eine Lineweaver-Burk-Gerade hat einen Achsenabschnitt von 0,08 s/µM und eine Steigung von 0,24 s·mM/µM. Bestimmen Sie Vmax und Km.
- Q3Warum hat ein kompetitiver Inhibitor bei sehr hoher Substratkonzentration keine Wirkung?
- Q4Viele Medikamente sind Enzyminhibitoren. Warum könnte ein Wirkstoffentwickler einen nichtkompetitiven Inhibitor bevorzugen?
- Q5Erklären Sie, warum die Messpunkte bei niedrigem [S] die Anpassung einer Lineweaver-Burk-Geraden dominieren.
Häufig gestellte Fragen
Ist Km dasselbe wie die Bindungskonstante des Substrats?
Nur wenn der katalytische Schritt viel langsamer ist als das erneute Ablösen des Substrats (k_cat viel kleiner als k₋₁). Im Allgemeinen umfasst Km auch k_cat. Ein niedriger Km-Wert bedeutet daher sowohl effiziente Bindung als auch effizienten Umsatz, nicht nur eine starke Bindung.
Warum wird der Lineweaver-Burk-Plot noch gelehrt, wenn er unzuverlässig ist?
Er verwandelt die Kurve in eine Gerade, wodurch sich die Muster verschiedener Inhibitoren leicht mit bloßem Auge erkennen lassen. Für genaue Zahlen passen Forschende die ursprüngliche Kurve mit einer nichtlinearen Regression an.
Ab wann folgt die Kurve dieser Gleichung nicht mehr?
Allosterische Enzyme, deren Untereinheiten kooperieren, wie etwa die Aspartat-Transcarbamoylase, ergeben stattdessen S-förmige Kurven. Sehr hohe Substratkonzentrationen können manche Enzyme ebenfalls hemmen.