關於此實驗
基質濃度較低時，基質越多，酵素作用得越快；但最終所有活性位點都會被佔據，反應速率也會趨於平穩。1913 年，Leonor Michaelis 和 Maud Menten 用兩個數值描述了這個現象：最高反應速率 Vmax，以及反應速率達到其一半時的基質濃度 Km。調整這兩個數值，加入三種抑制劑，觀察它們如何改變曲線和 Lineweaver-Burk 圖；接著分別用傳統方法和現代方法擬合含有雜訊的測定資料。
學習目標
- 從米氏方程式推導 Vmax 和 Km 的意義
- 從飽和曲線和 Lineweaver-Burk 圖中讀取 Km 和 Vmax
- 根據對表觀常數的影響，區分競爭性抑制、反競爭性抑制和非競爭性抑制
- 說明雙倒數圖為何會扭曲測量誤差
- 比較線性化擬合與非線性最小平方法擬合
使用方法
- 1沿著曲線拖曳。當 [S] 為多少時，反應速率是 Vmax 的一半？與 Km 對照確認。
- 2將 [S] 設為 10 Km。達到 Vmax 的幾分之幾？為什麼曲線始終無法完全達到 Vmax？
- 3加入競爭性抑制劑並增加 [I]/Ki。哪個常數會改變？在 Lineweaver-Burk 圖上，各直線在哪裡相交？
- 4對反競爭性抑制和非競爭性抑制重複上述操作。繪出三種 Lineweaver-Burk 圖的模式。
- 5將測量誤差設為 0.5，進行數次新的測定。比較 Lineweaver-Burk 法的估計值與非線性擬合結果。哪種方法較可靠？
- 6看看 Lineweaver-Burk 圖中最靠右的點。為什麼它們會對直線產生如此大的影響？
模型
假設
- 單一基質酵素的穩態動力學：基質相對於酵素大量過量，且只測量初始速率。
- 此處的非競爭性指純非競爭性抑制：抑制劑與游離酵素和酵素複合物的結合能力相同。圖中未顯示混合型抑制。
- 每次測定使用八種基質濃度，並為每個點加入大小相同的隨機誤差。隨機數產生器使用固定種子，因此可以重複執行並得到相同結果。
- 非線性擬合採用 v 對 [S] 的一般最小平方法，從 Lineweaver-Burk 估計值開始以 Gauss-Newton 法求解。
在課堂上試試這個實驗
- Q1某種酵素的 Vmax = 12 µM/s，Km = 3 mM。當 [S] = 1 mM 和 [S] = 9 mM 時，反應速率分別是多少？
- Q2Lineweaver-Burk直線的截距為0.08 s/µM，斜率為0.24 s·mM/µM。求Vmax和Km。
- Q3基質濃度非常高時，為什麼競爭性抑制劑不起作用？
- Q4許多藥物都是酵素抑制劑。藥物設計者為什麼可能更偏好非競爭性抑制劑？
- Q5解釋為什麼在Lineweaver-Burk擬合中，[S]較低的點影響更大。
常見問題
Km和基質的結合常數相同嗎？
只有當催化步驟遠慢於基質再次解離的步驟時才是如此（k_cat遠小於k₋₁）。一般而言，Km也包含k_cat，因此Km較低意味著結合和轉化都很有效，而不僅僅是結合緊密。
既然Lineweaver-Burk圖並不可靠，為什麼還要教它？
它能將曲線變成直線，使不同抑制劑的模式很容易透過目測辨認。要取得實際數值，研究人員會用非線性迴歸擬合原始曲線。
這條曲線從哪裡開始不再符合這個方程？
像天冬胺酸氨甲醯轉移酶這樣次單元會協同作用的變構酵素，會呈現S形曲線。受質濃度過高也可能抑制某些酵素。