この実験について
基質濃度が低いとき、酵素は基質が増えるほど速く働きます。しかし、やがてすべての活性部位が埋まり、反応速度は頭打ちになります。1913年、レオノール・ミカエリスとモード・メンテンは、この現象を2つの数値で表しました。最高速度であるVmaxと、その速度の半分に達する基質濃度であるKmです。両方の値を変え、3種類の阻害剤を加えて、それぞれが曲線とラインウィーバー・バークプロットをどう変化させるかを確認しましょう。さらに、ノイズを含むアッセイデータを、従来の方法と現代的な方法でフィッティングしてみましょう。
学習目標
- ミカエリス・メンテン式から Vmax と Km の意味を導き出す
- 飽和曲線とラインウィーバー・バークプロットから Km と Vmax を読み取る
- 見かけの定数への影響によって、競合阻害、非競合阻害、反競合阻害を区別する
- 二重逆数プロットが測定誤差を歪める理由を説明する
- 線形化したフィッティングと非線形最小二乗フィッティングを比較する
使い方
- 1曲線に沿ってドラッグしてください。反応速度が Vmax の半分になる [S] はいくつですか？Km と照らし合わせて確認してください。
- 2[S] を 10 Km に設定してください。Vmax の何割に達しますか？曲線が Vmax に完全には到達しないのはなぜですか？
- 3競合阻害剤を加え、[I]/Ki を大きくしてください。どの定数が変化しますか？ラインウィーバー・バークプロットでは、直線はどこで交わりますか？
- 4反競合阻害と非競合阻害でも同じ操作を行ってください。3種類のラインウィーバー・バークプロットのパターンをスケッチしてください。
- 5測定誤差を 0.5 として、新たに複数の測定を行ってください。ラインウィーバー・バーク法による推定値と非線形フィッティングの結果を比較してください。どちらの方が信頼できますか？
- 6Lineweaver-Burkプロットで最も右に位置する点を見てください。なぜそれらは直線にこれほど大きな影響を与えるのでしょうか？
モデル
前提条件
- 単一基質酵素の定常状態速度論：基質は酵素に対して大過剰であり、初速度のみを測定します。
- ここでいう非競合阻害は純粋な非競合阻害を意味し、阻害剤は遊離酵素と酵素複合体の両方に同程度に結合します。混合阻害は示していません。
- 各測定では8種類の基質濃度を用い、すべての点に同じ一定のランダム誤差を加えます。シード付きの乱数生成器を使うため、同じ実行を再現できます。
- 非線形フィットでは、Lineweaver-Burk推定値を初期値として、Gauss-Newton法で v と [S] の通常の最小二乗法を解きます。
授業で試してみましょう
- Q1ある酵素の Vmax = 12 µM/s、Km = 3 mM です。[S] = 1 mM と [S] = 9 mM のときの反応速度はいくらですか？
- Q2Lineweaver-Burkプロットの切片は0.08 s/µM、傾きは0.24 s·mM/µMです。VmaxとKmを求めてください。
- Q3基質濃度が非常に高いとき、なぜ競合阻害剤は効果を示さないのですか？
- Q4多くの薬は酵素阻害剤です。薬の設計者が非競合阻害剤を好むのはなぜでしょうか？
- Q5Lineweaver-Burkプロットのフィッティングでは、なぜ[S]が低い点が大きく影響するのか説明してください。
よくある質問
Kmは基質の結合定数と同じですか？
触媒反応の段階が、基質が再び解離する段階よりもはるかに遅い場合に限ります（k_catがk₋₁よりはるかに小さい場合）。一般にKmにはk_catも含まれるため、Kmが低いことは、強い結合だけでなく、結合と反応の両方が効率的であることを意味します。
信頼性が低いのに、なぜLineweaver-Burkプロットは今でも教えられているのですか？
曲線を直線に変換できるため、阻害剤の種類によるパターンを目で簡単に見分けられます。実際の数値を求める際、研究者は非線形回帰を用いて元の曲線をフィッティングします。
この曲線は、どこからこの式に従わなくなりますか？
アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼのように、サブユニットが協調して働くアロステリック酵素は、代わりにS字型の曲線を示します。また、基質濃度が非常に高いと、一部の酵素は阻害されることがあります。