この実験について
DNAフォークを開き、2種類の異なる合成順序に従ってヌクレオチドを選びます。リーディング鎖の合成は露出した鋳型に沿って連続的に進みます。一方、ラギング鎖の合成は、短く露出した断片内で逆向きに進みます。この理想化された演習では、誤った選択は受け付けられません。ライゲーションによって完成した断片をつなぎ、連続した娘鎖を作ります。
学習目標
- 両方の親鋳型に相補的な塩基対形成を適用します。
- 新しい2本の鎖の化学的な5′から3′への方向性を保ちます。
- 半保存的複製と、ラギング鎖の断片をつなぐ必要性について説明します。
使い方
- 1塩基対を1組開き、リーディング鎖に正しいヌクレオチドを加えます。
- 23つの塩基を露出させ、ラギング鎖の鋳型に切り替えて、その断片内で逆順になることを確認します。
- 3誤った塩基を試してから、両方の産物を手動で完成させるか、決定論的なデモを実行します。
- 4断片をライゲーションでつなぎ、それぞれの娘二本鎖に親鎖が1本ずつ残っていることを確認します。
モデル
前提条件
- 表示された親鎖は、インデックスが増加する方向に5′から3′へ進み、その相補鎖は3′から5′へ進みます。リーディング鎖の合成はインデックスが増加する方向に進みますが、ラギング鎖の合成では各断片内でインデックスが逆方向に進みます。
- 3塩基の断片にすることで演習の過程を確認しやすくなり、生物学的な岡崎フラグメントよりもはるかに短くなります。プライマーとその置換は行われるものとし、すべての塩基がそろった後にリガーゼがニックをつなぐものとします。
- このモデルでは1つの複製フォークだけを扱い、ミスマッチする選択肢はすべて不正解とします。開始過程、ATPの使用、トポロジカルストレス、修復経路、および生物種ごとのポリメラーゼ反応速度は対象外です。
授業で試してみましょう
- Q1鋳型が逆平行なのに、2本の新生鎖がどちらも5′から3′へ伸長できるのはなぜですか？
- Q2最終的な二本鎖DNAの各部分のうち、複製前から存在していたのはどれですか？
よくある質問
なぜラギング鎖は、1塩基分だけ開いた後すぐに合成を始められないのですか？
次の短い学習用断片は、露出した反対側の端から始まります。断片全体がまず利用可能になっている必要があります。
この演習では、誤ったヌクレオチドは突然変異になりますか？
いいえ。不一致はすべて拒否されます。別の突然変異実験では、配列に残る編集を調べます。